微课堂鸡传染性支气管炎检测诊断技术

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鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒引起鸡发生的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病。临床特征有患鸡喷嚏、咳嗽、呼吸困难和啰音等，患病雏鸡还可能出现流浆液性鼻液，产蛋鸡出现产蛋下降，蛋壳质量变差等。本病仅发生于鸡，无明显的品种差异。各种日龄的鸡都易感，但雏鸡最严重。发病季节多见于秋末至次年春末，但以冬季最为严重。环境因素主要是冷、热、拥挤、通风不良，特别是强烈的应激作用，如疫苗接种、转群等可诱发该病。本病传播迅速，常在1～2天内波及全群。传播方式主要是通过空气传播，此外，人员、用具及饲料等也是传播媒介。

一

检测诊断标准

表1鸡传染性支气管炎检测诊断标准（现行）

二

临床诊断

（一）临床症状自然感染的潜伏期为36h或更长。（1）雏鸡：无前驱症状，全群几乎同时突然发病。最初主要是呼吸道症状，流鼻涕、流泪、鼻肿胀、咳嗽、打喷嚏、伸颈张口喘气等。夜间可听到明显嘶哑的叫声。随着病情发展，症状加重，缩头闭目、垂翅挤堆、食欲不振、饮欲增加等。雏鸡感染可引起死亡。（2）产蛋鸡：表现轻微的呼吸困难、咳嗽、气管啰音，有“呼噜”声。精神不振、减食、拉黄色稀粪。产蛋鸡产蛋下降，产软皮蛋、畸形蛋，蛋清稀薄如水，种蛋的孵化率低。除了呼吸道型的症状，还存在肾型症状，病鸡主要排白色的稀粪，脱水，死亡率较高。（二）病理变化主要病变在呼吸道。在鼻腔、气管、支气管黏膜充血、水肿，管腔内可见有淡黄色半透明的浆液性、粘液性或干酪样渗出物。气囊可能浑浊或含有干酪性渗出物。产蛋母鸡卵泡充血、出血或变形；输卵管短粗、肥厚，局部充血、坏死。肾型还可见肾肿大、苍白，肾小管内尿酸盐沉积而扩张，肾呈花斑状，输尿管尿酸盐沉积而变粗。心、肝表面也有沉积的尿酸盐似一层白霜。有时可见法氏囊有炎症和出血症状。出现上述临床表现和病理变化者，可怀疑鸡群感染鸡传染性支气管炎病毒，但确诊需经实验室检验。

三

实验室检测诊断

表2鸡传染性支气管炎检测诊断方法（一）病毒的分离采集气管渗出物、支气管、肺组织的样本；肾型或者产蛋下降的病鸡取肾脏或者输卵管，将病料磨碎，加入含抗菌素的PBS制成体积分数为20%的组织悬液，冻融3次离心取上清液，加入终浓度为IU/ml的青霉素和链霉素，37℃下作用1h后接种于鸡胚，将分离物经鸡胚传至3代或3代以上，收获接种7天后仍存活的鸡胚，取胎儿，如胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2g以上者，可初步判断有病毒感染。（二）酶联免疫吸附试验用鸡传染性支气管炎病毒抗原包被96孔微量板，被检样品加入包被孔孵育，血清样品中的特异性鸡传染性支气管炎病毒抗体与包被的病毒抗原反应，形成复合物。经过洗涤，未结合的物质被去掉。微孔加入酶标抗体，酶标抗体可以与吸附在包被孔内的鸡抗体结合。反应后进行洗涤，未结合的酶标抗体被洗去。加入酶底物，随后的颜色反应强度与血清中的鸡传染性支气管炎病毒抗体的数量直接相关，以此可以诊断是否感染。（三）血凝抑制试验反应在96孔V型反应版上进行，第一列每孔加25μl的待检血清25ul，从左到右依次倍比稀释，每孔分别再加入25ul的4单位抗原，震荡混匀后室温反应30min，每孔分别再加25ul1%红细胞悬液，室温作用40min判定结果。以红细胞%不凝集的最高稀释度反应孔作为该血清的抑制价，以抗体小于4Log2判为阴性，大于4Log2判为阳性。（四）普通RT-PCR试验表3鸡传染性支气管炎PCR检测的引物经RT-PCR扩增反应后，待检样品在约bp和bp处分别出现一条特异性条带、或仅在约bp处出现特异性条带、或仅在约bp处出现特异性条带，均可判定鸡传染性支气管炎阳性，否则为阴性（五）气管环组织培养血清中和试验取18~20日龄的鸡胚，用碘酊消毒气室部位，无菌取出鸡胚，用眼科剪剪开鸡胚颈部皮肤，拔出气管，取出气管周围的结缔组织和脂肪，取出气管与含U/ml青霉素和μg/ml链霉素的Hank’s液中轻轻清洗两遍，然后用眼科剪将气管剪成1mm厚的气管环组织。将气管环组织置于一个青霉素瓶内，加入含2%犊牛血清的MEM培养基1ml，置37℃培养箱内培养24h后，取出置倒置显微镜下观察，见气管环组织培养物上皮完整纤毛运动活泼，即可作为传染性支气管炎病毒的滴定。用不含犊牛血清的MEM培养液按10-1至10-9稀释抗原，每个稀释度的培养液接种5个气管环组织培养物，取15个不接种病毒的气管环培养物，每个加入1ml稀释液作为空白对照。置36℃温箱内培养6d后判定结果。结果判定如下：1.++：气管环组织培养物周边无一个纤毛运动，上皮细胞脱落2.+：气管环组织培养物周边95%以上纤毛运动停止运动，上皮细胞不完全脱落3.±：气管环组织培养物周边50%~95%以上纤毛运动停止运动，上皮细胞不脱落4.-：气管环组织培养物周边纤毛运动正常，上皮细胞不脱落以气管环组织培养物表现“++”或“+”记为感染，以表现“±”或“-”记为不感染。

四

防治措施

做好平时的综合性兽医卫生防疫措施，严格执行隔离、检疫等；鸡舍要注意通风换气，防止过挤，注意保温，加强饲养管理，补充维生素和矿物质饲料，增强鸡体抗病力，同时配合疫苗进行人工免疫，做好病鸡群的隔离，对病死鸡无害化处理，同时对环境严格消毒。

中科基因鸡传染性支气管炎病检测诊断能力

表4中科基因鸡传染性支气管炎病检测诊断能力

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